Musikalische Komödie rund um ein zweifach vermietetes Zimmer: Hans ist Nachtkellner, Grete Maniküre. Bei der geschäftstüchtigen Vermieterin Seidelbast bewohnen beide dasselbe Zimmer – er bei Tag und sie bei Nacht. Eines Tages begegnen sich Grete und Hans, die sich bis dahin nie getroffen haben. Ohne zu wissen, dass es sich beim jeweiligen Gegenüber um den unbekannten und als nervig empfundenen Untermieter handelt, verlieben sie sich ineinander. Zahlreiche Missverständnisse und Verwechslungen sind die Folge, bevor es im gemeinsamen Schlafzimmer zum Happy End für die beiden kommt.

Der Film ist ein Beispiel für herausragenden deutschen Musikfilm zum Beginn der Tonfilmzeit. Komponiert wurde die Musik von Werner Richard Heymann, die Texte zu den Liedern schrieb Robert Gilbert. Gemeinsam schufen sie auch zahlreiche Hits für die populären Comedian Harmonists, die in Ich bei Tag und du bei Nacht einen Gastauftritt im Nachtlokal „Casanova“ haben. Weitere Titel singen die Hauptdarsteller Willy Fritsch und Käthe von Nagy. Neben Heymann wird der Film von weiteren bedeutenden Exilanten geprägt: Regisseur Ludwig Berger, Drehbuchautor Robert Liebmann und Produzent Erich Pommer.
Das Motiv des geteilten Zimmers wird übrigens auch in neuen Produktionen aufgegriffen: So spielt die deutsche Krimiserie Babylon Berlin in der dritten Staffel ganz direkt auf Bergers Film und die prekäre Wohnsituation seiner Protagonisten an!
 
Der Film konnte im Jahr 2014 von einer Nitrokopie des Gosfilmofond of Russia in 2K digitalisiert werden. Die Digitalisierung wurde gefördert von der BKM.